28℃で25日間静置培養した後、ヒラタケNRC620由来のラッカーゼは真菌培養培地中で最も高い活性を示した。この酵素の最適pHと最適温度はそれぞれ3.0と70℃であった。40℃と50℃で2時間培養した後、酵素活性はそれぞれ68.33%と59.61%保持された。クエン酸リン酸緩衝液（pH 7.0）で2時間培養した後、酵素活性は100%のままであった。10 mMのMgSO₄とCuSO₄を添加すると、酵素活性はそれぞれ約21%と35%増加したが、NaCl、MnCl₂、KCl、およびCaCl₂は酵素活性を阻害した。 ABTSを基質として用いた場合、*Pleurotus ostreatus* NRC 620ラッカーゼの反応速度パラメータ（KmおよびVmax）はそれぞれ1.99 mMおよび16,217 μmol min−1 L−1であった。リンゴジュースサンプルの酵素処理により、pHと粘度の両方が大幅に低下し、この低下は保存期間の増加と相関していた。ラッカーゼ処理によりリンゴジュースの総フェノール含量はわずかに減少したが、抗酸化活性の低下は観察されなかった。
近年、研究者たちは食品産業におけるグリーンバイオテクノロジーの応用に着目している。ラッカーゼは食品産業において最も有用な酵素の一つであり、ジュース加工、製パン、ワインの安定化、食品の官能特性の向上など、様々な分野で応用されている。1多くの高等植物や微生物はラッカーゼを分泌する。2また、不完全菌類、子嚢菌類、担子菌類などの真菌もラッカーゼを産生することができる。3ラッカーゼ（EC 1.10.3.2）は、3種類の銅原子からなる系を用いて分子状酸素を水に還元する青色の酸化酵素であり、様々なフェノール化合物や芳香族アミンを酸化します。果物や野菜ジュースの製造過程において、酵素的および非酵素的な褐変は重要な問題となります。4これらの物質はジュースの色、風味、香りに悪影響を与えるため、除去しなければならない。5
リンゴは、あらゆる果物の中で、世界および欧州連合において最も消費量の多い果物である。2019年のリンゴ生産量は8700万トンを超え、世界第3位となった。6リンゴには、フラボノイドやカフェ酸、クロロゲン酸などのフェノール酸を含む、数多くのフェノール化合物が含まれている。7リンゴジュースは通常、透明な状態で消費されるため、ろ過の過程でフェノール成分の約50％から90％が失われる。8今日、消費者はポリフェノール含有量の高い濁りリンゴジュースなど、加工を最小限に抑えた製品を選ぶ傾向にある。しかし、フェノール含有量が高いため、この種のリンゴジュースは変色や黒ずみが起こりやすい。9リンゴジュースの変色を軽減または防止するために、60～90℃での低温殺菌などの加熱処理方法を含む様々な技術が用いられている。10しかし、サウセダ・ガルベスの研究によると、11加熱処理は揮発性化学物質を破壊し、リンゴジュースの官能特性に影響を与える可能性があります。加熱処理の代替方法としては、超臨界二酸化炭素、紫外線照射、超音波処理、高静水圧処理、高圧均質化処理などがあります。12これらの技術の効率性や、適切な果汁の収量は、使用するパラメーターと製品の特性によって左右される。しかし、高コスト、一部の食品の品質への悪影響、あるいは酵素の不活性化が不十分であるといった問題により、その普及は制限されている。13,14
ラッカーゼは、果汁の安定化と透明化に利用できる。15ギョクメンら16果汁の清澄化にはラッカーゼの使用を推奨します。ラッカーゼはフェノール化合物をポリマーまたはオリゴマーに変換して効果的に除去し、あらゆる限外ろ過膜で容易に除去できるため、リンゴジュースは50℃で最大6週間、安定した色と透明度を維持できます。精製された*Trichoderma*ラッカーゼをアルミナビーズに固定化し、リンゴジュースの微生物汚染によって引き起こされる異臭化合物を選択的に除去するために使用しました。17
リンゴジュースの揮発性成分の約80～90％はエステル類とアルデヒド類であり、これらがジュースに独特の香りを与えている。18リンゴジュースの清澄化のために、若いココナッツの殻から作られた天然繊維でできた安価な担体上に、*Trametes versicolor*由来のラッカーゼを固定化した。19これまでの研究では、酵素を用いない方法、固定化法、あるいは限外ろ過との組み合わせを用いて、リンゴジュースの安定化（色と濁度）について検討されてきた。5,19しかし、貯蔵中のリンゴジュースの物理化学的特性に対する真菌ラッカーゼの影響は不明のままです。したがって、本研究の目的は、真菌ラッカーゼ処理後、2週間冷蔵保存したリンゴジュースの物理化学的特性、フェノール化合物含有量、および抗酸化活性の変化を実験的に調査することでした。ラッカーゼはフェノール化合物を酸化する能力があり、ジュースの清澄化を含むさまざまな工業プロセスでの使用が期待されています。本研究では、*Pleurotus ostreatus* NRC 620由来のラッカーゼを調べ、ジュースの清澄化におけるその活性と有効性の理想的な条件に焦点を当てました。ヒラタケ（P. ostreatus NRC 620）に関する研究はまだ限られていますが、これまでの研究では、Trametes versicolorやGanoderma lucidumなどのさまざまな真菌由来の酵素が調べられています。本研究の目的は、食品産業におけるこの酵素の潜在的な応用を評価し、特に理想的なpHと温度などの独自の特性を強調することでした。
2,2′-アゾオキシビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)（ABTS）は、Sigma-Aldrich社（カナダ）から購入した。その他の試薬はすべて分析用グレードのものを使用した。
国立研究センターの微生物培養コレクションセンターは、既知のヒラタケ菌株NRC620を入手した。継代培養後、この菌株は4℃のポテトデキストロース寒天斜面培地に保存された。接種源の調製方法は以下のとおりである。10日齢の完全に発達した菌糸体をポテトデキストロース寒天プレートに接種し、28℃で培養した。10日後、滅菌金属パンチを使用して寒天培地から直径12mmの菌糸ブロック3個を取り出し、50mLの滅菌培養培地（pH 5.0、Othmanらによって以前に説明されている）を含む綿栓付き250mL三角フラスコに入れた。20培養は28℃で18日間インキュベートした。その後、培養液をワットマンNo.1ろ紙でろ過し、得られた上清を酵素源とした。
ラッカーゼ活性は、ABTSを基質として測定した。反応混合物（2 mL）は、0.3 mM ABTS（0.1 Mクエン酸ナトリウム緩衝液、pH 4.5に溶解）500 μLと、蒸留水で希釈した所定量の酵素サンプルから構成された。21,22ラッカーゼは室温（28℃±2）でABTSを酸化できることを考慮し、ABTSの酸化は420 nm（ε）での吸光度の増加を測定することによって決定した。420= 36,000 cm-1 M -1アジレント社製Carry-100 UV分光光度計を用いて測定した。1単位のラッカーゼ活性は、1分間に1μmolのABTSを酸化するのに必要であった。タンパク質濃度は、内部標準としてウシ血清アルブミンを用いたブラッドフォード法により測定した。23,24
ヒラタケ菌株NRC 620から酵素を得た後、28℃の静置条件下で25日間、異なる培養間隔でその活性を測定した。
ラッカーゼ活性に対する温度の影響を調べるため、20～90℃の温度範囲で実験を行った。酵素を添加して反応を開始する前に、緩衝液（0.1 M クエン酸ナトリウム、pH 4.5）と基質（ABTS）を混合し、様々な温度で5分間インキュベートした。酵素の熱安定性は、0.05 M リン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.0）中で、40、50、60、70℃でそれぞれ2時間インキュベートすることにより評価した。その後、ABTS基質を用いて残存活性を評価した。
pHがラッカーゼ活性に及ぼす影響を、pH範囲2.5～7.0の0.1 Mクエン酸-リン酸緩衝液中でABTSを基質として評価した。酵素溶液を0.1 Mクエン酸緩衝液およびトリス緩衝液（pH 3、4、6、7）中で40℃で2時間インキュベートし、pH安定性を評価した。インキュベーション後、ABTSを基質とした残存活性を算出した。
ラッカーゼを、様々な金属イオン（Mg2+、Cu2+、Co2+、Ca2+、Zn2+、K+、Na+、およびMn2+）をそれぞれ2.5 mMおよび10 mMの濃度で含むリン酸ナトリウム緩衝液（0.05 M、pH 7.0）中で10分間インキュベートした。その後、基質（ABTS）を添加して反応を開始させ、相対活性を評価した。
様々な濃度（0.025～3 mM）のラッカーゼによるABTS酸化をpH 4.5で測定し、速度論的パラメータ（VmaxおよびKm）を決定した。定数ミカエリス・メンテン式の反応速度定数は、基質濃度に対する反応速度の逆数をプロットしたラインウィーバー・バークプロットを用いて算出された。反応速度定数は、GraphPad Prismバージョン6.01ソフトウェアを用いてラインウィーバー・バークプロットから計算された。
リンゴを水道水でよく洗った後、半分に切り、全自動のブラウンMP80リンゴジューサー（ドイツ製）でジュースにした。ジュースは4枚重ねのガーゼで濾過した。対照群には酵素を添加しなかったが、調製したばかりのリンゴジュースには2.0%のラッカーゼ（試験した中で最も効果的な濃度）を添加し、4℃で2週間保存した。
滴定酸度（TA）とpHは、Boultonらの方法に従って測定した。al.27各サンプルのpHはデジタルpHメーター（JENWAY 3510 pHメーター）を用いて測定した。滴定酸度（TA）は、リンゴ酸を基準として以下の式を用いて算出した。
ここで、VとCはそれぞれ滴定に使用した水酸化ナトリウム溶液の体積（mL）と濃度（0.1 mol/L）である。Kはリンゴ酸の変換係数で、0.067に等しい。Wはリンゴジュースの質量（g）である。
総可溶性固形分（TDSすべてのジュースサンプルの水分含有量は、PAL-1ポケット屈折計（ATAGO、東京、日本）を使用して測定した。各測定後、光学レンズを脱イオン水で洗浄し、各リンゴジュースサンプルを3回測定した。各サンプルの値は、3回の測定値の平均によって算出した。各リンゴジュースサンプルの平均値±標準偏差も、これらの結果を平均して算出した。
リンゴジュースサンプルの粘弾性は、回転式粘度計（RV、Rheotest 2、ドイツ）を用いて評価した。サンプルは粘度計の「S2」シリンダー内に設置した。見かけ粘度は、せん断応力とせん断速度の関係を示す曲線の傾きで表され、これは様々なせん断速度（1.00～437.4 s⁻¹）におけるせん断応力と対応する曲線から算出した。見かけ粘度の計算式は以下のとおりである。
ここで、ηは見かけ粘度（cP）、τはせん断応力（dyn/cm²）、γはせん断速度（sec⁻¹）であり、τはトルク（α）とシリンダー（Z）の値を使用して次の式で計算されます：τ = Z . α。
褐変指数はMeidavらの方法に従って決定した。al.2910 mlのジュースサンプルを2750 xgで10分間遠心分離した。ジュースの上清5 mlを95%エタノール5 mlと混合した。混合液の吸光度を島津製作所製UV分光光度計（UV-1601 PC）を用いて420 nmで測定した。
総フェノール含有量（TPC）は、Boultonらによって記載されたFolin-Ciocalteu試薬を用いて比色法により測定した。[27]. 0～500 mg/Lの濃度範囲で没食子酸の標準曲線を作成した（r²= 0.997)。結果は没食子酸当量（mg GAE/mL）で表されます。
25 μLのリンゴジュースに125 μLの蒸留水と2850 μLのFRAP溶液を加え、混合物を暗所に置いて30分。次に、島津UV分光光度計（UV-1601 PC）を使用して593 nmの吸光度を測定します。FRAP試薬は、300 mM酢酸緩衝液（pH 3.6）、20 mM塩化鉄(III)、および10 mM 2,4,6-トリス(2-ピリジル)トリアジン（TPTZ）（40 mM HClに溶解）を10:1:1の比率で混合して調製しました。標準としてトロロックスを使用して標準曲線を作成しました（R²= 0.999)であり、結果はμMトロロックス/mLで表される。
処理済みおよび未処理のジュースの抗酸化活性は、DPPH法を用いて測定し、DPPHフリーラジカルを消去する能力を評価した。3110マイクロリットルのジュースをメタノール中のDPPH溶液（100 μM）1 mlと混合した。暗所で30分間反応させた後、混合液の吸光度を島津UV分光光度計（UV-1601 PC）を用いて517 nmで測定した。結果は、検量線（R2= 0.990)。
得られたデータによると、NRC 620ヒラタケでは発酵18日目にラッカーゼの最大生産量が観察され、活性は1302 U/Lに達した。これがラッカーゼ生産の最適培養時間を決定する基礎となった（図1）。酵素生産量は培養時間の増加とともに増加したが、増加率は培養時間に直接比例するわけではなかった。21日後には、酵素活性はわずか90 U/L（1390 U/L）しか増加していなかった。したがって、生産量と培養時間延長による経済的利益のバランスを考慮して、最終的に18日間が最適培養時間として選択された。
ヒラタケNRC 620におけるラッカーゼ収量に対する培養時間の影響。3つの（12 mm）菌糸ブロックを50 mlの滅菌培地に接種し、28 °Cで異なる時間培養した。
他の研究結果と一致して、我々の結果は、真菌によるラッカーゼ分泌が最大となる理想的な培養期間は7日から36日の間である可能性が高いことを示している。32Ezikeらによると、33*Trametes polyzona* WRF03 は、発酵 9 日目までに最も多くのラッカーゼを生成し、比活性は 1637 U/mg タンパク質であった。さらに、Othman らは、34*Trichoderma harzianum* S7113は培養5日目に大量のラッカーゼを分泌することがわかった。ラッカーゼの産生速度は14日目にピークに達し、その後徐々に減少した。34酵素分泌は主要な成長期にも起こり得るが、通常は中間期にピークを迎え、炭素源または窒素源の消費によって引き起こされる。34,35
ヒラタケNRC 620由来のラッカーゼは、50℃から80℃までの広い温度範囲で高い活性を示し、ピーク活性（69～98%）に近づいたものの、最大活性は70℃で観察された（図2a）。この温度範囲外では、酵素活性は約70℃で低下した。これらの結果は、高温によって反応の運動エネルギーが増加するため、この酵素は高温でも活性を示すことを示唆している。
ヒラタケ（Pleurotus ostreatus）NRC 620におけるラッカーゼ活性に対する反応温度（a）およびpH（b）の影響。20～90℃の温度範囲は、酵素を添加して反応を開始する前に、混合物を異なる温度で5分間プレインキュベートすることによって達成した。pHがラッカーゼ活性に及ぼす影響は、0.1 Mクエン酸リン酸緩衝液を含む溶液中でABTSを基質として、pH2.5～7.0の範囲で評価した。
Ezike etによるとal.33*Trametes polyzona* WRF03 ラッカーゼの最適温度は 55 °C であり、これは *Ganoderma lucidum* の最適温度と同じです。ラッカーゼ36そして、*Trametes polyzona* KU-RNW02737 の最適温度 (50 °C) と類似している。ラッカーゼ . バルドリアン38他のリグニン分解酵素系と同様に、ラッカーゼの理想的な温度範囲は50～70℃であると指摘されている。
結果によると、この酵素は pH 3.0 で最も高い活性を示し、pH 3.5 で 94% の活性に達しました。しかし、pH 2.5 から 7.0 の広い範囲で活性を維持しました (図 2b)。さらに、中性またはアルカリ性条件と比較して、酸性条件でより高い活性を示しました。pH 2.5 から 4.5 の範囲で少なくとも 77% の活性を維持しましたが、pH 7.0 では約 38% にしか達しませんでした。*Trametes polyzona* WRF03 由来のラッカーゼの最適 pH は 4.533 であり、これは *Trametes polyzona* KU-RNW02737、*Trichoderma harzanium* 39、*Pleurotus* sp. 40、および *Trametes hirsuta* 41 由来のラッカーゼの pH と同じです。しかし、Chairin らの研究によると、42*Polymorpha f. sp.* WR710-1由来のラッカーゼの最適pHは2.2であるのに対し、*Polymorpha f. sp.* IBL-04由来のラッカーゼの最適pHは5.043である。水酸化物アニオン（ラッカーゼ阻害剤）がT2/T3ラッカーゼの銅原子に結合することが、中性またはアルカリ性pH条件下でのラッカーゼ活性の低下の原因である可能性がある。これにより、T1中心からT2/T3中心への内部電子移動が阻害され、制限する酵素活性23,44
酵素をさまざまな温度でインキュベートしたところ、インキュベーション時間と温度の両方が酵素の安定性に影響を与えることがわかりました。特に、*Trametes polyzona* NRC 620由来のラッカーゼは、40℃と50℃でより高い安定性を示し、120分後にはそれぞれ初期活性の68.33%と59.61%を保持していました（図3a）。一方、同じ条件（40℃と50℃、120分）では、*Trametes polyzona* WRF03由来のラッカーゼは、それぞれ活性の64.38%と42.92%を保持していました。33それとは対照的に、培養時間と温度の上昇は、*Trametes polyzona* NRC 620 ラッカーゼの安定性を低下させました。60℃と70℃で60分間培養した後、その活性はそれぞれ39.24%と1.72%に低下しました（図3a）。実験結果と一致して、*Trametes polyzona* WRF03 由来のラッカーゼは、熱処理プロセス全体を通して40℃と50℃でより高い安定性を示しました。33同様に、Lueangjaroenkit らal.37およびチャイリンらal.42トラメテス・ポリゾナKURNW027およびトラメテス・ポリゾナWR710-1由来のラッカーゼの安定性は、それぞれ50℃で1時間で報告されている。様々なバイオテクノロジー分野で応用可能な有用な生体触媒として、ラッカーゼは幅広い温度範囲で良好な安定性と性能を示す必要がある。
*Pleurotus ostreatus* NRC 620由来ラッカーゼの熱安定性（a）およびpH安定性（b）。熱安定性は、酵素溶液を0.05 Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.0）中で40、50、60、70℃でそれぞれ2時間インキュベートすることにより評価した。pH安定性は、酵素溶液を0.1 Mクエン酸緩衝液およびトリス緩衝液（pH 3、4、6、7）中で40℃で2時間インキュベートすることにより評価した。インキュベーション後、ABTSを基質として残存活性を算出した。
酵素の使用と保存の最適な条件を決定するために、pH がラッカーゼの安定性に及ぼす影響を調査しました。異なる pH 値への曝露は、タンパク質構造の安定性に大きく影響し、それによって酵素分子の安定性と活性に影響を及ぼしました。結果は、酸性条件下では酵素の安定性が低く、より高い pH 値 (中性およびアルカリ性領域) では安定性が高いことを示しました。pH 値が 7.0、6.0、4.0、および 3.0 の場合、120 分後の酵素保持率はそれぞれ約 100%、62.54%、52.39%、および 11.14% でした (図 3b)。*Strombus multisus* WRF03 ラッカーゼは、中性 pH 値 (5.5～6.5) でより高い安定性を示し、酸性 pH 値 (4.0 未満) ではより低い安定性を示しました。 pH値が5.5、6.0、6.5の場合、120分後の酵素保持率はそれぞれ約82%、100%、93%であった。33カイリンら42Trametes polyzona WR710-1由来のラッカーゼはpH 6.0～7.0の範囲で安定していることが指摘されている一方、Sayedらは、45ラッカーゼは中性pH条件下でより安定であることが示された。しかし、Cerrena unicolor由来のラッカーゼはアルカリ性条件（pH 9.0）でも安定性を示した。46研究対象としたラッカーゼは、幅広いpH範囲で高い安定性を示した。これは、工業用途において重要な特性となる可能性がある。
金属イオンの中には、酵素活性に対して促進作用と阻害作用の両方を持つものがあるため、工業用途においては、酵素活性に対する金属イオンの影響を考慮する必要がある。これは、金属イオンが一般的な環境汚染物質であり、細胞外酵素の安定性や合成に影響を与える可能性があるため、非常に重要である。47*Pleurotus ostreatus* NRC 620由来のラッカーゼに対する複数の金属イオンの影響を調べるため、対応する実験を行った。図4に示すように、使用する金属の種類に応じて、金属イオン濃度を2.5 mMから10 mMに増加させると、酵素機能に悪影響を及ぼした。例えば、Mg²⁺ , Co²⁺ , Zn²⁺、 そしてCu²⁺酵素活性を刺激し活性化する可能性がある一方、Na⁺ , Mn²⁺ , Ca²⁺、 そしてK⁺酵素活性を阻害する可能性がある。10 mMの濃度では、Cu²⁺イオンとMg²⁺イオンは、*Pleurotus ostreatus* NRC 620由来のラッカーゼ活性を最も強力に活性化し、それぞれ約34%と20%の活性化度を示した。しかし、10 mMの濃度では、Ca²⁺イオンはラッカーゼの最も強力な阻害剤であり、酵素活性を約60%低下させた。
ヒラタケNRC 620ラッカーゼの活性に対する金属イオンの影響。ラッカーゼを、2.5 mMおよび10 mMの濃度で様々な金属イオンを含むリン酸ナトリウム緩衝液（0.05 M、pH 7.0）中で10分間インキュベートした。その後、基質（ABTS）を添加して反応を開始し、相対活性を測定した。
我々の結果は、Mg²⁺とCu²⁺が*Trametes polyzona* WRF03³の活性を高めることを発見した他の著者らの結果と一致している。Castañoら⁴⁸は、*Xylaria* sp.由来のラッカーゼが銅イオン（Cu²⁺）によってある程度刺激されることを発見した。さらに、Foroutanfarら⁴⁹とSiら⁵⁰は、それぞれ*Paraconiothyrium variabile*と*Trametes pubescens*由来のラッカーゼについて同様の研究を行った。この酵素のタイプII銅結合部位（T2）は、特定の濃度でCu²⁺で飽和することができ、これが高濃度のCu²⁺³⁹でのラッカーゼ活性の刺激を説明できる可能性がある。白色腐朽菌のラッカーゼは複数の銅原子を含む酸化酵素であるため、銅イオンがラッカーゼ活性に及ぼす影響は多様であり、促進作用、阻害作用、中立作用など多岐にわたる。⁵¹ 対照的に、Zhou らは、[52]報告によるとCu²⁺台湾シロアリ（Odontotermes formosanus）のラッカーゼ活性を阻害した。しかし、Cerena sp. HYB07のラッカーゼは[53]およびクリトシベ・マキシマ[54]銅イオンの影響を受けなかった。
基質特異性は、その反応速度論的パラメータ（KmとVmax）によって表される。基質と酵素の結合親和性が強いほど、Km値は低くなり、基質特異性は高くなる。3,21,55*Pleurotus ostreatus* NRC 620由来のラッカーゼの反応速度パラメーター（KmおよびVmax）は、GraphPad Prism 6.0ソフトウェアを用いてLineweaver-Burkプロット（図5）を作成することにより決定した。ABTSを基質として用いた場合、結果は1.99 mMおよび16217 μmolであった。分⁻¹ L⁻¹、それぞれ。Elsayed et al.21ABTS酸化のKm値はそれぞれ0.1 mMと0.064 mMであり、Lac AおよびLac BアイソザイムがABTSに対して高い親和性を持つことが報告されている。さらに、Vmax値は0.182 μmolであった。分⁻¹および0.603μmol分⁻¹それぞれ。得られた Km 値は Trametes polyzona WRF03 (8.66 mM) よりも低く、さらに Vmax 値 (1429 mmol min⁻¹) もより低いABTSを基質として使用した場合、33 同様に、Lentinus squarrosulus MR13およびTrametes sp. AH28-2ラッカーゼ濃度のKm値はそれぞれ0.0714 mMおよび0.025 mMであり、Vmax値は0.0091 mM min−1および0.67 mM min−1 mg−1（ABTSに対する相対値）であった。それぞれ56,57
ヒラタケ（*Pleurotus ostreatus* NRC 620）由来のラッカーゼの活性に対するABTS濃度の影響を調査し、初期反応速度の逆数とABTS濃度の関係を示すLineweaver-Burkプロットを作成した。pH 4.5で、異なる濃度（0.025～3.0 mM）のラッカーゼを用いたABTSの酸化反応を測定し、速度論的パラメータ（VmaxおよびKm）を決定した。反応速度の逆数と基質濃度の関係を示すLineweaver-Burkプロットを用いて、ミカエリス・メンテン速度定数を算出した。速度定数は、GraphPad Prism 6.01ソフトウェアを用いてLineweaver-Burkプロットから算出した。
ペクチナーゼなどの従来の清澄化酵素は、ペクチン質を加水分解して粘度と濁度を低下させます。これらの酵素は構造多糖類を効果的に分解し、収率と透明度を向上させるために、セルラーゼやヘミセルラーゼなどの他の酵素と組み合わせて使用されることがよくあります。しかし、ペクチナーゼはフェノール化合物を特異的に標的とするわけではありません。フェノール化合物は、特にリンゴジュースやブドウジュースなどのジュースにおいて、濁りや酸化による褐変の主な原因となります。58一方、ラッカーゼはフェノール化合物の酸化を触媒し、それらを重合させてより大きな不溶性分子にすることで、沈殿または濾過によって除去できるようにします。このメカニズムは、透明度を向上させるだけでなく、フェノール化合物による酸化褐変の可能性を低減することで、ジュースの保存期間を延長します。さらに、ラッカーゼを用いた清澄化プロセスは、穏やかな処理条件（pH 3.5～5.5、温度 25～40℃）で実施できるため、栄養価や官能特性を損なうことなく、繊細なジュースにも適しています。59研究によると、ペクチナーゼ処理は1～2時間でジュースを清澄化できるのに対し、ラッカーゼ処理はフェノール化合物を完全に除去するために通常3～6時間というより長い反応時間を必要とする。しかし、このプロセスは酵素を固定化したり、ラッカーゼと機械的清澄化法を組み合わせたりすることで最適化できる。60本研究において、粗抽出物の酵素プロファイリングを行った結果、ラッカーゼとα-アミラーゼの活性が顕著に認められた一方、ペクチナーゼとキシラナーゼの活性は極めて低く、セルラーゼ活性は検出されなかった。したがって、濁度とフェノール含量の減少は主にラッカーゼの作用によるものであり、粘度の変化は部分的にアミラーゼの作用によるものと考えられる。
表1は、搾りたてのリンゴジュースとラッカーゼ処理したサンプルの物理化学的パラメータを示している。結果によると、搾りたてのリンゴジュースの収率（71.59%）は、ラッカーゼ処理したサンプルの収率（87.34%）よりも低かった。これらの結果は、PilnikとOrangeの研究結果と一致している。61酵素を果物加工に用いることで、果汁収量の増加、濾過性の向上、濃縮に適した高品質で透明な果汁の取得が可能になると指摘されている。果汁収量の増加は主に果汁中の可溶性糖含量の増加によるものである。果実の酵素加水分解の過程で、果実の細胞壁にあるメソグレアとペクチンが破壊され、中性糖や酸などの可溶性物質に変換される。62 .酵素処理したリンゴジュースのpH値は対照群よりも有意に低く（P < 0.05）、両群のpH値は保存中に有意に上昇した（表1）。これらの結果はMarkらの結果と一致している。63加熱処理後の保存期間において、カシューフルーツジュースのpHが低下したことを指摘した。酵素処理後のペクチン分解とガラクツロン酸生成が、保存期間中のpH上昇の原因であると考えられる。酵素処理したサンプルのpHは保存期間を通して4.05～4.31の範囲に留まったが、未処理のリンゴジュースのpHは4.12～4.33の範囲であった。
未処理サンプルとラッカーゼ処理サンプルの両方において、総酸度（TA）は保存期間の増加に伴い減少傾向を示した（表1）。酸度の低下は、有機酸が炭水化物に変換されたこと、酵素反応、およびジュースの保存中の酸化によるものと考えられる。64対照リンゴジュースと酵素処理サンプルの総酸度は、他のジュース（イチゴジュース0.9%、プラムジュース2.2%、キンカンジュース1.0%、アプリコットジュース2.4%、オレンジジュース0.8%）よりも低かったが、他のジュース（例えば、梨ジュース0.3%）と同程度であった。62未処理の搾りたてリンゴジュースにおけるこれらの違いは、栽培条件、遺伝的要因、成熟度、加工方法など、さまざまな要因によるものと考えられる。65対照リンゴジュースとラッカーゼ処理リンゴジュースの総酸度の低下は、Singh らによって示された結果と一致している。6674日間の保存後の金諾りんごジュースの総酸度の低下に関して。一方、OshmianskyとWojdyloは67従来の清澄化方法の影響を調べたところ、リンゴジュースの酸性度に有意な変化は見られなかった。
表1に示す結果は、ラッカーゼ処理したリンゴジュースの総可溶性固形分（TSS）値が未処理のサンプルよりも高いことを示している。これらの結果は、既発表の研究結果と一致している。.68さらに、表1は、対照リンゴジュース群のTSS値が初期時点で9.58であり、保存期間終了時には11.05に達したことを示している。これらの値は、Hamidらによって報告された新鮮なリンゴジュースのTSS値よりも低い。.69（それぞれ 11.2 および 11.80）。ラッカーゼ処理したリンゴジュースサンプルの TSS 値は、11.23 から始まり、4 ℃ で 2 週間保存後に 12.93 に達し、有意に増加しました（表 1）。保存中の TSS の同様の増加は、柑橘類、レモン、スイートオレンジでも観察されました。保存中の全可溶性固形分 (TSS) の増加は、多糖類 (デンプン) の単糖類 (糖) への加水分解、ジュースの脱水による濃度の増加、およびジュース中のペクチンの可溶性固形分への分解による可能性があります。全可溶性固形分 (TSS) の増加は、可溶性糖の増加によるものと考えられます。可溶性糖は、ペクチンまたはセルラーゼによるペクチンまたはセルロースの可溶性糖への変換、または Hamed らによって報告されているようにデンプンの糖への加水分解によって形成される可能性があります。69.ラッカーゼがリンゴジュースの特性に及ぼす影響は視覚的にも確認でき、ラッカーゼ処理したリンゴジュースは未処理のジュースよりも流動性が高く、粘度が低いことがわかった。この結果は表1に示されている。酵素処理したサンプルの粘度は1.87 cPであったのに対し、対照サンプルの粘度は2.95 cPであった。この粘度の著しい低下は、ペクチン様物質の保水能力の向上と、凝集性のあるネットワーク構造の形成によるものと考えられる。
本研究では、分光光度計を用いて420 nmにおける吸光度を測定することにより、ラッカーゼがリンゴジュースの褐変指数（BI）に及ぼす影響を調査した。結果を表1に示す。保存中、処理群と未処理群の両方のリンゴジュースサンプルのBIは徐々に増加する傾向を示した。BIは褐変の程度を反映しており、重要な酵素的および非酵素的褐変反応の指標。吸光度は保存中に有意に増加した（P < 0.05）。保存終了時には、A420対照群と酵素処理群のリンゴジュースサンプルの値は、それぞれ約 217% と 121% 増加しました (表 1)。この結果は、酵素処理が褐変度を約 56% 効果的に低減できることを示しています。Bezerra らの結果。[19]は我々の結果と一致しています。彼らはラッカーゼ-グルタルアルデヒド-ココナッツ繊維を使用してリンゴジュースを清澄化し、元の色を61%減らしました。
果汁に含まれるポリフェノールは、人体に栄養面および治療面で有益な効果をもたらす一方で、タンパク質と反応して果汁の濁り、沈殿、または濁度を引き起こし、製品の風味や香りを変化させ、保存期間を短縮させる可能性もある。71本研究の目的は、ヒラタケNRC 620由来のラッカーゼを用いてリンゴジュースのフェノール化合物含有量を安全に低減することであった。表1に示す結果は、ラッカーゼ処理したリンゴジュースの総フェノール化合物含有量が4℃での保存前に有意に減少したことを示している。さらに、総フェノール化合物含有量は、調査した両方のサンプルで保存中にも減少した（表1）。Sandriらによる研究。72酵素処理したリンゴジュースは抗酸化活性とフェノール化合物含有量を維持できることが示された。しかし、Lettera らによる研究の結果は、73真菌ラッカーゼでオレンジジュースを処理すると、オレンジジュース中のフェノール化合物の含有量を最大45％削減できることが示されている。
フェノール化合物は、フリーラジカルの捕捉、一重項酸素の還元および消光、水素原子の移動、フリーラジカルへの電子供与などの特性を有することが示されており、強力な抗酸化物質である。74したがって、本研究では、DPPH法とFRAP法を用いて、冷蔵庫に14日間保存したリンゴジュースの抗酸化活性に対するラッカーゼの効果を評価した（表2）。どちらの方法も保存中に抗酸化活性の増加を示したが、これは遊離フェノール化合物の増加またはメイラード反応生成物（MRP）の形成によるものと考えられ、抗酸化活性の増加の原因はメイラード反応生成物である可能性が高い。75非酵素的褐変反応（アスコルビン酸の分解、メイラード反応、酸触媒による糖の分解など）によって褐色の色素（メラノイジン）が生成される。アスコルビン酸の中間分解生成物や糖の分解生成物（カルボニル化合物など）は、メイラード反応によってアミノ酸と反応することがある。76果物や野菜の貯蔵中の褐変については広範な研究が行われてきたが、これらの反応に関する我々の理解は依然として限られている。77FRAP法と比較すると、ラッカーゼ処理したリンゴジュースはDPPH法による抗酸化活性が有意に低く（表2）、すべてのサンプルの抗酸化活性は保存期間の増加とともに有意に増加した。本研究では、原理が異なるため、抗酸化活性を測定する2つの異なる方法を用いた。DPPH法はフリーラジカルを中和する能力を測定するのに対し、FRAP法は鉄イオンを還元する能力を測定する。したがって、研究対象サンプルの抗酸化活性をよりよく理解するためには、抗酸化活性を測定する複数の方法を用いることが推奨される。78
この研究の重要な発見の 1 つは、*Pleurotus ostreatus* ラッカーゼ NRC 620 が 70 °C および pH 3.0 で最適な活性を示すことです。*Trametes versicolor* や *Ganoderma lucidum* ラッカーゼなど、ジュースの清澄化に一般的に使用される他の真菌ラッカーゼと比較すると、*P. ostreatus* NRC 620 はより高い熱安定性とより酸性の pH を示します。*Trametes versicolor* および *Ganoderma lucidum* 由来のラッカーゼは通常、50～60 °C の範囲で、pH 値が 3.5～5.0 の間で最適な活性を示します。この違いは、特に低い pH 値での安定性が重要な酸性ジュースの場合、ジュースの清澄化効率の向上に貢献する可能性があります。*P. ostreatus* NRC 620 の独自の特性は、他の研究対象となった真菌ラッカーゼと比較して、*Pleurotus ostreatus* NRC 620はより厳しい条件下でも効果的に機能する能力を示します。その高い最適活性温度は、反応速度の速さや微生物汚染の低減など、工業用途における潜在的な利点を示唆しています。多くのジュースの酸性度に適した低いpHは、ジュースの清澄化プロセスに役立つ可能性があります。これらの結果は、大規模用途に向けたさらなる研究を正当化し、*Pleurotus ostreatus* NRC 620を従来の真菌ラッカーゼ源の有力な代替品としています。以前の研究と比較すると、最適温度は60℃、最適pHは3.0であることがわかりました。60℃で80分間反応させた後、*Ganoderma lucidum*ラッカーゼは46その活動の79％。クルニアワティとニセルによると80霊芝（Ganoderma lucidum）の酵素は、25℃、pH 5.0～8.0の範囲で優れた安定性から中程度の安定性を示し、pH 6.0、10～30℃の温度範囲でも安定性を示します。本研究では、ヒラタケ（Pleurotus ostreatus）の酵素活性の最適pHと最適温度はそれぞれ3.0と70℃であることがわかりました。40℃と50℃で2時間インキュベートした後、酵素はそれぞれ68.33%と59.61%の活性を保持しました。さらに、ヒラタケNRC 620ラッカーゼは、50℃から80℃の広い温度範囲で高い活性を示し、ほぼ最大活性（69%～98%）に達し、最大活性は70℃で観察されました。
結論として、静置条件下で得られたヒラタケ由来ラッカーゼNRC620は、幅広いpHおよび温度条件下で最適な活性と安定性を示し、他の酵素源と比較して優れた安定性を示した。10 mMのMgSO₄とCuSO₄を添加すると、酵素活性はそれぞれ約21%と35%増加した。リンゴジュースに加工した場合、この酵素はpHと粘度を低下させたが、保存中のフェノール含量はわずかに減少しただけであった。
今回の結果は、食品産業、特に飲料の清澄化におけるラッカーゼの可能性を裏付けるものです。ラッカーゼはフェノール化合物を特異的に分解することで、濁度を低減し透明度を向上させるだけでなく、穏やかな条件下でも果汁の品質を維持します。ゼラチン、ベントナイト、シリカゲルといった従来の清澄剤とは異なり、ラッカーゼは廃棄物を発生させず、飲料の心地よい香りを損なうこともないため、より環境に優しく持続可能な選択肢となります。さらに、他の酵素やろ過方法と比較して、ラッカーゼは製品の品質を損なうことなく、的を絞った費用対効果の高いソリューションを提供します。
Kyomuhimbo, HD および Brink, HG. 銅含有ラッカーゼの応用と固定化戦略；レビュー。Heliyon 9, e13156 (2023).
投稿日時：2025年12月15日